Diagnostic fondé sur l’amplification des acides nucléiques
Détection moléculaire du paludisme
La microscopie et les tests diagnostiques rapides sont les principaux choix pour diagnostiquer le paludisme sur le terrain, mais aucune de ces méthodes ne permet de détecter les infections palustres de faible densité, courantes tant dans les contextes de faible que de forte transmission.
Les tests d’amplification des acides nucléiques (TAAN) ont une bonne sensibilité de détection pour les infections palustres de faible densité (inférieure à 1 parasite/µl).
Leur utilisation relève de quatre catégories générales:
- détection parasitaire qualitative ou quantitative;
- détermination de la multiplicité de l’infection;
- génotypage pour distinguer la recrudescence de la réinfection; et
- détection des mutations pharmacorésistantes.
À l'heure actuelle, l'OMS recommande que l'utilisation des TAAN ne soit envisagée que pour la recherche épidémiologique ou les enquêtes de cartographie des infections inframicroscopiques dans les zones de faible transmission.
Types de tests d’amplification des acides nucléiques
Les techniques de réaction en chaîne par polymérase (PCR), notamment la PCR nichée (n), quantitative (q) ou en temps réel après transcription inverse (RT-PCR), l’amplification isotherme induite par boucle (LAMP) et l’amplification de séquences d’acides nucléiques quantitative (QT-NASBA) comptent parmi les principaux TAAN développés pour détecter le paludisme. Les TAAN peuvent donner des résultats quantitatifs et qualitatifs, et de nombreux tests ont également été mis au point pour la détection spécifique des parasites en phase sexuée et asexuée. Le gène 18S de l'ARN ribosomique est fréquemment ciblé pour l’amplification car il comporte des séquences uniques permettant l’identification des cinq espèces responsables du paludisme chez l’homme: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae et P. knowlesi.
Les tests d’amplification des acides nucléiques peuvent différer selon le matériel et l'infrastructure requis, le traitement des échantillons avant l'amplification, la température de réaction, le délai d’obtention du résultat, la facilité d'utilisation, la limite de détection ou le coût, mais tous les tests sont réalisés en effectuant essentiellement les mêmes étapes. La plupart nécessitent une étape d'extraction des acides nucléiques suivie d'une amplification, qui peut se dérouler à une température unique ou par cyclage à différentes températures. Selon la méthode choisie, la détection ou la quantification peut être déterminée de l’une des manières suivantes:
- visuellement sur un gel d'agarose sous lumière ultraviolette;
- en examinant les tubes réactionnels dans un turbidimètre; ou
- par l’incorporation de marqueurs fluorescents dans la réaction, permettant ainsi une surveillance continue en temps réel de la formation du produit pendant l'amplification, suivie d'une comparaison avec des témoins titrés
connus.
Conseils pour les tests moléculaires
Les méthodes de détection moléculaire peuvent produire un grand volume d’acide nucléique par l’amplification des quantités traces trouvées dans les échantillons. Bien que cela favorise une bonne sensibilité de détection, cela introduit également la possibilité d’une contamination par l'environnement de laboratoire. Des mesures peuvent être prises pendant la réalisation des expériences pour éviter la contamination.
Plus d’informations concernant les précautions pouvant réduire la contamination
Évaluation de la qualité des TAAN
Bien que les TAAN offrent une bonne sensibilité de détection, les rapports indiquent que la reproductibilité est imparfaite, en particulier lors de la détection de parasitémies de faible densité. Dans le but de renforcer la fiabilité et la comparabilité des données, un programme international d’évaluation externe de la qualité a été mis en œuvre pour améliorer les normes de performance de ces tests pour le paludisme. Ce programme fournit du matériel de référence destiné à l’évaluation externe de la qualité pour l’infection au stade érythrocytaire, à diverses densités de parasites, sous forme de sang lyophilisé et de taches de sang séché. La première série de tests a commencé début 2017. Pour obtenir plus d’informations sur les modalités de participation, veuillez envoyer un courrier électronique à cunninghamj@who.int.